臺大醫院內科部／盛望徽
摘要
在臨床醫療中，針對革蘭氏陰性桿菌，特別是綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、Stenotrophomonas maltophilia、鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii)及腸內菌(Enterobacteriaceae)等的多重抗藥性是一越來越急迫的問題。過去多重抗藥性的發生被認為是由很多機轉建構而成，但是近年來的研究發現在這些病原體內因性及後天的多重抗藥性中，在菌體細胞膜上由一種3合體結構(trimer)所形成的多重藥物輸出幫浦系統可同時導致多種抗生素抗藥性的發生，此藥物輸出幫浦廣泛存在於革蘭氏陰性桿菌及其他病原體，且在不同的細菌間其基因序列上可鑑定此三合體的藥物輸出幫浦系統屬於同源性的蛋白結構(homologues)，它們可以促使微生物以ATP耗能方式或電解質離子能差將多種抗生素及有害物質輸出菌體外，而得以適應惡劣的環境(如酸、鹼、抗生素、膽鹽等)，特別的是：這些系統也常常會對抗生物製劑(biocides;如洗手液或消毒劑)產生輸出作用，當環境中使用大量的抗生素及抗生物製劑時，亦會篩選出此種多重抗藥性的革蘭氏陰性桿菌。由於此類藥物輸出幫浦系統對於各式各樣的化學受質均可能有影響，一些新發展的化學藥劑也會被此類輸出系統排出，因此針對未來革蘭氏陰性菌的治療趨勢，發明輸出系統拮抗劑，將是一個重要的課題。
前言
自從一九二O年代佛萊明發現盤尼西林後，隨著時代的進步，抗生素一個個如雨後春筍般被發掘出來，拯救了許多病菌感染患者，但由於長期大量的使用抗生素於醫療及相關畜牧業，抗藥性的問題接踵而來。革蘭氏陰性桿菌，特別是院內感染常見的綠膿桿菌，Stenotrophomonas maltophilia，鮑氏不動桿菌等非葡萄糖發酵性細菌更是與生俱來有多重抗藥性的特質，因而在治療上十分困難。另外近年來各類抗生素逐漸開發廣泛應用於臨床治療及農牧業，故造成人類與動物物種高抗藥性致病菌如大腸桿菌(Escherichia coli)，克來伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)也在增加，而此種多重抗藥性革蘭氏陰性桿菌在臨床上已被報告可造成患者高致病率與高致死率。造成細菌抗藥性的機轉不外乎有三類：(一)分泌酵素直接破壞抗生素；(二)改變抗生素作用在菌體部位之結構而使抗生素無法接合；(三)藉由關閉孔道以減少藥物自細胞膜外滲透(permeability)至菌體內，或發展一套藥物輸出幫浦(efflux pump)，依賴消耗ATP能量或使用鈉-鉀離子差能(gradient)，將抗生素自菌體內排出至菌體外，以減少抗生素堆積。這些細菌產生多重藥物抗藥性的原因，可能是細菌本身發生多次自發性突變(mutation)，或自外界不斷交換及累積藥物抗藥性基因而來。但近年來微生物學家發現：細菌因環境改變而內因性表現抗生素輸出幫浦基因，可能是促使細菌發展多重抗藥的主要原因。本篇文章內容將探討多重藥物性輸出幫浦在革蘭氏陰性桿菌對抗藥性的影響、多重抗藥性輸出幫浦之種類及其受質(substrates)、細菌如何藉由環境改變引發輸出幫浦系統之活化以及藥物輸出幫浦對細菌的重要性。
| 一、多重抗藥性輸出幫浦的結構與其分類 |
| |
在許多革蘭氏陰性桿菌的染色體中本來就帶有此段輸出幫浦基因但平日未表現，因此許多革蘭氏陰性桿菌如Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii等先天即具有多重抗藥性，一旦外界環境改變(如酸鹼值、抗微生物製劑等)的介入，該菌為求適應環境，就會表現幫浦基因，這一段抗藥基因也可藉由細菌接合以染色體片段(chromosome)或質體(plasmid)方式再傳至其他菌種。細菌的多重藥物輸出幫浦，依其輸出之藥物種類及特性可區分為五大類：
| 1. |
MFS家族(major facilitator super family) |
| 2. |
ABC家族(ATP-binding cassette family) |
| 3. |
RND家族(resistance-nodulation division) |
| 4. |
SMR家族(small multi-drug resistance) |
| 5. |
MATE家族(multi-drug and toxic compound extrusion) |
其中最常見的是RND家族，且並不限定在革蘭氏陰性桿菌，許多革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)也有此幫浦，而ABC幫浦家族主要在真核細胞如黴菌(fungus)或寄生蟲(parasite)上，而其他MFS, MATE, SMR幫浦家族輸出幫浦較為少見且引起之抗藥性低，在臨床上意義不大。典型的幫浦結構為2個外膜蛋白(outer-membrance protein)及1個細胞膜間質融合蛋白(periplasmic membrane fusion protein)所組成，除ABC幫浦家族是藉由水解ATP產生能量提供幫浦輸出藥物，其餘幫浦家族是藉由鈉、氫離子差能輸出藥物，圖一表示革蘭氏陰性桿菌各種不同多重抗藥性輸出幫浦之基本結構。
RND幫浦家族
臨床上對抗生素及其他許多抗生物製劑而言，最常見也是最重要的就是RND幫浦家族。最早發現RND幫浦家族與革蘭氏陰性桿菌fluoroquinolone之抗藥性有關，但隨後發現此幫浦可排出其他不同結構之抗生素(如aminoglycosides, tetracycline, β-lactams等)、抑生物製劑(如chlorhexidine，四級胺)、染劑(dyes)、清潔劑(detergents)、細菌代謝物質(metabolites)、有機溶劑(organic solvents)、毒性脂肪酸(toxic fatty acids)、膽鹽(bile salts)。近年來在Pseudomonas aeruginosa亦發現RND幫浦(MexAB-OprM系統)可協助釋放細菌毒素，在細菌致病性上扮演一個十分重要的角色。多重藥物輸出幫浦亦可排出一種稱為homoserine lactones的物質，其主要功能是細菌間傳遞訊息，與細菌之致病力及生存力亦有直接相關。
RND多重藥物輸出幫浦，不僅廣泛存在於人類、動植物相關之細菌上，在許多非致病性細菌上也具有此幫浦。除Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii等非葡萄糖發酵革蘭氏陰性桿菌具有外，陸續在Vibrio cholerae, Citrobacter freundii, Proteus vulgaris也發現RND藥物輸出幫浦，它們均與fluoroquinolone之抗藥性有關。Escherichia coli, Neisseria gonorrheae, Legionella pneumophilia, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumonia, S. maltophilia, Serratia marcescens, Campylobacter jejuni等各類不同菌株亦發現此幫浦家族基因與tetracycline、macrolides及aminoglycosides之抗藥性相關，並已定序。(表一陳述RND幫浦家族相關之發現，表二陳述非RND多重抗藥性輸出幫浦。)
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| 二、抗生素(antibiotic)-抗生物製劑(biocide)之交叉抗藥性(cross-resistance) |
| |
研究觀察E. coli菌的多重藥物輸出幫浦AcrAB系統(屬於RND家族，為三種膜蛋白組合AcrAB-TolC)與Pseudomonas aeruginosa菌Mex系統(MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN)顯示這些幫浦不但會排出菌體內抗生素，也會排出一些抗生物製劑。這也說明醫院或環境中過度使用抗生素及抗生物製劑(如清潔劑、洗手液、消毒液等)，亦可能同時篩選出具有此類幫浦之多重抗藥細菌。雖然，使用清潔劑及洗手時消毒液濃度很高，細菌較不易存活，但是洗手後或環境清潔後殘留了較低濃度的抗生物製劑，就容易篩選出此類多重抗藥菌株。在實驗中E.coli及Pseudomonas aeruginosa被證實可經由抑菌製劑篩選出變異菌株，藉著發展藥物輸出幫浦(如Acr幫浦系統或Mex幫浦系統)，而由原本單純非抗藥菌株轉變為多重抗藥性菌株。
|
| 三、多重抗藥幫浦系統與其他抗藥機轉有加成作用 |
| |
前面已經提過革蘭氏陰性桿菌抗藥性的機轉有一部分是藉由胞膜通道蛋白關閉，減少藥物進入菌體；另外已經進入菌體的抗生素，可藉由抗藥幫浦再將抗生素打出菌體外。在研究中證實；多重抗藥幫浦膜蛋白與胞膜孔道蛋白(porins)的基因調控可以互相協同，一方面表現幫浦基因排出抗生素，一方面關閉孔道蛋白使抗生素無法再進入，而達到加強菌體抵抗微生物製劑的能力。另外，在E.coli MarA多重抗藥幫浦基因的研究中發現：當細菌遭遇fluoroquinolone抗生素環境時，細菌會發展AcrAB多重抗藥幫浦，同時也會加強在fluoroquinolone標的位置基因(target site)DNA gyrase gene的突變(mutation)，而使fluoroquinolone無法接合於標的酵素，使抗藥性明顯上升數十倍。
|
| 四、如何克服多重藥物輸出幫浦引起之多重抗藥性 |
| |
目前有兩個方面可達到克服多重藥物輸出幫浦引起之抗藥性：
1.發展幫浦抑制劑，直接抑制幫浦作用。
2.改變抗生素結構，使抗生素不容易成為多重抗藥性幫浦之受質。
目前針對細菌之抗藥性，已有多種幫浦抑制劑被開發出來，且實驗中證實可有效抑制藥物輸出幫浦之作用，但仍未有臨床藥物使用之經驗；另外，新一類glycylcyline(tigecycline, GAR-936)抗生素，雖然開發源自tetracycline(四環黴素)，但實驗設計中改變化學結構證實tigecycline不會被E.coli及Pseudomonas aeruginosa之多重抗藥幫浦排出，因而對於多重抗藥性菌株如S. maltophilia及A. baumannii具有不錯之療效；但，對於P. aeruginosa某些菌株的MexAB-OprM, MexCD-OprJ及Mex XY-OprM幫浦系統，此藥仍會被打出菌體外。由於多重藥物輸出幫浦作用的藥物範圍很廣，因此，新的微生物製劑或尚未開發的抗生素均有可能仍是此類多重藥物輸出幫浦之受質而無法殺死具有某些特異多重抗藥幫浦系統之細菌。因此持續開發幫浦拮抗劑仍然十分重要。其他可抑制幫浦系統可能的機制還有：j針對此幫浦蛋白開發治療性疫苗k離子性抗菌生?(cationic peptides)或噬菌體(phages)，直接破壞幫浦蛋白。
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| 五、細菌多重藥物輸出幫浦系統在自然界的作用 |
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細菌究竟為何會發展多重藥物輸出幫浦？猜測中的原因很多：如前所述在Pseudomonas aeruginosa的Mex系統(Mex XY-OprM)可輸出多種抗生素(如erythromycin, tetracycline, gentamicin)以及抗生物製劑(如實驗室常用的rhodamine 6G dye, acriflavine, ethidium bromide, 四級胺消毒劑如benzallcon chloride，及洗手液chlorhexidine)，可能是Pseudomonas藉由在醫院或實驗室中的環境影響基因調控而發展幫浦系統以抵抗惡劣環境而適合生存；另外，如E.coli的AcrAB幫浦系統，可排出腸內常有的毒性脂肪酸(toxic fatty acids)及膽鹽(bile salts)，藉此可保護E.coli在人體腸內環境生存而不被此類毒性物質所影響，且E.coli可以很經濟的利用一種幫浦系統就排出多種毒性物質。輸出幫浦另外一個功能是：排出細菌的中間代謝產物或菌體內之廢物。在E.coli的AcrAB系統及Pseudomonas的MexAB系統可排出細菌代謝氧化還原脂蛋白isoflavanoids物質。由於前述革蘭氏陰性桿菌的RND家族幫浦系統很普遍存在於各菌種，且蛋白序列同源性(homology)很高；因此推斷藥物輸出幫浦系統廣泛存在於革蘭氏陰性桿菌的原始作用，可能是源於細菌本身排出菌體內代謝產物的自然機制轉變而來。 |
結論
多重抗藥性革蘭氏陰性桿菌是目前臨床上治療很棘手的問題，其中常見的原因是細菌發展出多重藥物輸出幫浦系統，此輸出幫浦廣泛存在於多種革蘭氏陰性桿菌中，且其蛋白具有同源性，原始目的可能是細菌為求適應於不易生存的環境(環境壓力)及為排出中間代謝產物或毒害物質而形成。這種幫浦不但可以將進入菌體內的多種化學結構相異的抗生素打出，也可排出抗生物製劑，另外，幫浦系統基因亦可協同調控其他抗藥性基因而使抗藥性提高數十倍。使用抗菌製劑過後殘餘的洗手液及消毒液濃度亦可引發藥物輸出幫浦活化而導致篩選出多重抗藥性細菌。由於多種藥物輸出幫浦系統可以作用於許多化學結構迥異之抗菌物質，因此開發新的藥物時，有可能成為此幫浦系統之受質而失去抗菌作用。探討多重藥物輸出幫浦之結構及基因調控，以及開發幫浦抑制劑已成為現代抗菌治療上的一大挑戰。
表一、各種不同革蘭氏陰性桿菌之RND多重抗藥性輸出幫浦(僅列臨床上常見細菌) |
細菌 |
|
|
可輸出受質 |
|
|
|
| Acinetobacter baumannii |
AdeA |
AdeB |
AdeC |
adeST |
AG, CX,TC, ER, CM, TP, FQ
|
| Burkholderia cepacia |
CeoA |
CeoB |
OpcM |
|
CM, CP, TP |
| Enterobacter aerogenes |
AcrA |
AcrB |
TolC |
acrR |
FQ, CM,TC, ACR, NOV, SDS, BS |
| Escherichia coli |
AcrA
AcrE
AcrA
|
AcrB
AcrF
AcrD
|
TolC
TolC
TolC
|
acrR
marA
robA
soxS
sdiA
|
AH, BA, BL,NV, ER, FU,
FQ, TC, CM,
EB,AC, CV, SDS
TX, BS, TS, PO, FA,
MX, LN,
AG, RD
|
| Hemophilas influenzae |
AcrA |
AcrB |
- |
- |
RF, ER, NV
EB, AC, CV, SDS
|
| Klebsiella penumoniae |
AcrA |
AcrB |
- |
acrR |
FQ |
Nesseria genorrheae
Nesseria meningitidis
|
MtrC |
MtrD |
MtrE |
mtrR
mtrA
|
AZ, ML, RF
PN, TX, CV, CP
|
| Proteus mirabilis |
AcrA |
AcrB |
- |
acrR |
TG, MN, CP, NV
CM, ER, EB, AC, TP
SDS
|
| Pseudomonas aeruginosa |
MexA
MexC
MexE
MexX
MexJ
|
MexB
MexD
MexF
MexY
MexK
|
OprM
OprJ
OprN
OprM
OprM
|
MexR
nfxB
MexT
MexZ
MexL
|
BL, FQ, CM, NV, TP, TG, SM, EB, AC, CV, SDS, AH, HL, CL, TL, IR, TS, TPP, RD |
| Salmonella |
AcrA |
AcrB |
TolC |
acrR |
BS, SDS, DOC, CH, TX, CV, AC, FA, NV, ER, RF, TC, CM, NOR, NAL, BL, FQ |
可輸出受質縮寫:
AC, acriflavine; ACR, acridines; AG, aminoglycosides; AH, aromatic hydrocarbons; AP, ampicillin; AQDS, anthaquinone-2,6-disulphonate; AZ, azithromycin; BA, benzalkonium; BL,  -lactams; BS, bile salts; CB, carbenicillin; CH, cholate; CL, cerulenin; CM, chloramphenicol; CP, ciprofloxacin; CV, crystal violet; CX, cefotaxime; DOC, deoxycholate; DOX, doxyrubicin; EB, ethidium bromide; ER, erythromycin; FA, fatty acids; FU, fusaric acid; FQ, fluoroquinolones; GN, gentamicin; HL, homoserine lactones; IR, irgasan; LN, linezolid; ML, macrolides; MN, minocycline; MX, methotrexate; NAL, nalidixic acid; NOR, norfloxacin; NV, novobiocin; PM, puromycin; PN, penicillin; PO, pine oil; RD, rhodamine; RF, rifampicin; SDS, sodium dodecyl sulphate; SM, sulphonamides; ST, streptomycin; TC, tetracycline; TG, tigecycline; TL, thiolactomycin; TO, toluene; TS, triclosan; TP, trimethoprim; TPP, tetraphenyl phosphonium; TX, Triton X-100; VA, vanadium.
| 表二、非RND多重抗藥性輸出幫浦 |
| 細菌 |
輸出幫浦名稱 |
調控基因 |
可輸出受質 |
ABC
|
MATE |
SMR |
MFS |
|
Bacteroides fragilis |
BexA |
- |
NorA |
- |
- |
NOR, EB, PM, FQ, EB |
| Burkholderia cepacia |
- |
NorM |
BcrA |
- |
- |
TC, NAL |
| Escherichia coli |
- |
YdhE(NorM) |
|
|
|
NAL, PMA, HU, TL, EB, ACR, MPP, MV, TC, TPP, AG, BA, CM, DM, EB, ER, FQ, PTG, PM, RD, RF, TC, TPP |
| Nesseria gonorrhoeae |
- |
NorM |
- |
- |
- |
EB, AC, NOR, CP, BA |
| Nesseria meningitidis |
- |
NorM |
- |
- |
- |
EB, AC, NOR, CP, BA |
| Pseudomonas aeruginosa |
- |
- |
- |
EmrE |
- |
EB, ACR, MV, AG |
| Vibrio cholera |
- |
NorM |
VceB |
- |
- |
DOC, CCCP,
CM, ER, PMA, PCP, NAL, NOR, CP, AG, EB |
可輸出受質縮寫:
AC, acriflavine; ACR, acridines; AG, aminoglycosides; BA, benzalkonium; BER, berberine; CCCP, carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone; CM, chloramphenicol; CP, ciprofloxacin; CV, crystal violet; DM, daunomycin; DOC, deoxycholate; EB, ethidium bromide; ER, erythromycin; FQ, fluoroquinolones; GN, gentamicin; HU, hydrophobic uncouplers; IPTG, isopropyl--D-thiogalactopyranoside; MPP, methyltriphenylphosphonium; MV, methyl vialogen; NAL, nalidixic acid; NOR, norfloxacin; PCP, pentachlorophenol; PF, proflavin; PM, puromycin; PMA, phenylmercuric acetate; QAC, quaternary ammonium compounds; RD, rhodamine; RF, rifampicin; TC, tetracycline; TL, thiolactomycin; TPC, tetraphenylarsonium chloride; TPP, tetraphenyl phosphonium
| 圖一革蘭氏陰性桿菌各種不同多重抗藥性輸出幫浦之基本結構。外膜蛋白(OMF)，細胞膜間質融合蛋白(MFP)。 |
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參考資料
- Waterer GW, Wunderink RG.. Increasing threat of Gram-negative bacteria. Crit Care Med 2001; 29: N75-N81.
- Livermore DM. Bacterial resistance: origins, epidemiology, and impact. Clin Infect Dis 2003; 36: S11-S23.
- Niederman MS. Impact of antibiotic resistance on clinical outcomes and the cost of care. Crit Care Med 2001; 29: N114-N120.
- Poole K. Outer membranes and efflux: the path to multidrug resistance in gram-negative bacteria. Curr Pharm Biotechnol 2002; 264: 167-188.
- Webber MA, Piddock LJ. The importance of efflux pumps in bacterial antibiotic resistance. J Antimicrob Chemother 2003; 51:9-11.
- Pradel E, Pages JM. The AcrAB-TolC efflux pump contributes to multidrug resistance in the nosocomial pathogen Enterobacter aerogenes. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46: 2640-2643.
- Gayet S, Chollet R, Molle G, Pages JM, Chevalier J. Modification of outer membrane protein profile and evidence suggesting an active drug pump in Enterobacter aerogenes clinical strains. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47:1555-1559.
- Mazzariol A, Zuliani J, Cornaglia G, Rossolini GM, Fontana R. AcrAB efflux system: expression and contribution to fluoroquinolone resistance in Klebsiella spp. Antimicrob Agents Chemother 2002: 46: 3984-3986.
- Cousin JS, Whittington WL, Roberts MC. Acquired macrolide resistance genes and the 1 bp deletion in the mtrR promoter in Neisseria gonorrhoeae. J Antimicrob Chemother 2003; 51: 131-133.
- Soto SM, Ruiz J, Mendoza MC, Vila J. In vitro fluoroquinolone-resistant mutants of Salmonella enterica serotype Enteritidis: analysis of mechanisms involved in resistance. Int J Antimicrob Agents 2003; 22: 537-540.
- Higgins PG, Fluit AC, Milatovic D, Verhoef J, Schmitz FJ. Mutations in GyrA, ParC, MexR and NfxB in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Int Antimicrob Agents 2003; 21: 409-413.
- Sobel ML, McKay GA, Poole K. Contribution of the MexXY multidrug transporter to aminoglycoside resistance in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47: 3202-3207.
- Magnet S, Courvalin P, Lambert T. Resistance-nodulation-cell division-type efflux pump involved in aminoglycoside resistance in Acinetobacter baumannii strain BM4454. Antimicrob Agents Chemother 2001; 45: 3375-3380.
- Nishino K, Yamaguchi A. Analysis of a complete library of putative drug transporter genes in Escherichia coli. J Bacteriol 2001; 183: 5803-5812.
- Visalli MA, Murphy E, Projan SJ, Bradford PA. AcrAB multidrug efflux pump is associated with resuced levels of susceptibility to tigecycline (GAR-936) in Proteus mirabilis. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47: 665-669.
- Nagakubo S, Nishino K, Hirata T, Yamaguchi A. The putative response regulator BaeR stimulates multidrug resistance of Escherichia coli via a novel multidrug exporter system, MdtABC. J Bacteriol 2002; 184: 4161-4167.
- Baranova N, Nikaido H. The BaeSR two-component regulatory system activates transcription of the yegMNOB (mdtABCD) transporter gene cluster in Escherichia coli and increases its resistance to novobiocin and deoxycholate. J Bacteriol 2002; 184: 4168-4176.
- Masuda N, Church GM. Escherichia coli gene expression responsive to levels of the response regulator EvgA. J Bacteriol 2002; 184: 6225-6234.
- Nishino K, Yamaguchi A. EvgA of the two-component signal transduction system modulates production of the YhiUV multidrug transporter in Escherichia coli. J Bacteriol 2002; 184: 2319-2323.
- Li Y, Mima T, Komori Y et al. A new member of the tripartite multidrug efflux pumps, MexVW-OprM, in Pseudomonas aeruginosa. J Antimicrob Chemother 2003; 52: 572-575.
- Sanchez P, Alonso A, Martinez JL. Cloning and characterization of SmeT, a repressor of the Stenotrophomonas maltophilia multidrug efflux pump SmeDEF. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46: 3386-3393.
- Nishino K, Yamada J, Hirakawa H, Hirata T, Yamaguchi A. Roles of TolC-dependent multidrug transporters of Escherichia coli in resistance to β-lactams. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47: 3030-3033.
- Rouquette-Loughlin C, Dunham SA, Kuhn M, Balthazar JT, Shafer WM. The NorM efflux pump of Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitides recognizes antimicrobial cationic compounds. J Bacteriol 2003; 185: 1101-1106.
- i X-Z, Poole K, Nikaido H. Contributions of MexAB-OprM and an EmrE homologue to intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa to aminoglycosides and dyes. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47: 27-33.
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